인폐 미혈관 내피세포

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인폐미혈관내피는 자폐조직을 분리한다.폐는 기체의 호흡기관으로서 흉강에 위치해있으며 좌우가 각각 하나이고 심장우에 덮여있다.폐에는 분엽이 있는데, 왼쪽에서 두 번째, 오른쪽에서 세 번째, 모두 다섯 잎이다.폐경폐계 (기관, 기관지 등을 가리킴.) 는 목구멍, 코와 연결되어 있기 때문에 목구멍을 폐의 문호라고 하고, 코는 폐외요라고 한다.미혈관 내피세포는 재생, 발육, 상처 치유 등 일련의 생리 및 염증 반응에 밀접하게 참여한다.세포는 북형이나 다각형으로 단층을 형성한 후 자갈모양이나 포장석모양으로 배열된다.폐미세혈관 내피세포는 반선택성 장벽을 구성하는데, 이 장벽은 폐 기체의 교환에 있어서 액체와 가용물의 혈액과 폐 간질 사이의 흐름을 조절하는 데 중요한 의미를 가진다.

방법 소개:

실험실에서 분리된 사람의 폐 미세혈관 내피는 조직 블록법을 채택하고 내피세포 전용 배양기 배양 선별과 결합하여 제조한 것으로, 세포 총량은 약 5 × 10 cells/병이다.

품질 검사:

실험실에서 분리된 사람의 폐미세혈관내피는 CD31 면역형광감정을 거쳐 순도가 90% 이상에 달하며 HIV-1, HBV, HCV, 지원체, 세균, 효모와 진균 등이 함유되지 않았다.

패키지 피조건PLL(0.1mg/ml) 또는 젤라틴(0.1%)

배양기FBS, 성장 첨가물, Penicillin, Streptomycin 등 포함

환액 주파수2 ~ 3일에 한 번씩 환액하다

성장 특성벽에 붙이다

세포 형태내피세포 샘플

세대 간 특성2-3세대 가능

소화액0.25%

준비 작업

1.실험기자재 준비: 무균의 배양접시, 배양병, 이액관, 원심관, 수술기구 등을 준비하고 고압멸균 또는 기타 적합한 소독처리를 한다.

2.시약 준비: 적합한 배양기, 소화효소 (예: 콜라겐효소 등), 태우혈청, 쌍항 등 시약을 조제 또는 구매하여 무균하고 유효기간 내에 확보한다.

3.실험동물 또는 조직원천준비: 실험수요에 따라 적합한 동물을 선택하고 상응한 마취 또는 처형을 진행하여 필요한 조직을 획득한다.또는 기존 조직 샘플 라이브러리에서 조직을 가져옵니다.

취재와 처리

1.취재: 무균조건하에서 목표조직을 신속히 제거하여 조직에 대한 손상을 최소화하고 불필요한 지방, 결단조직 등 비목적조직을 제거한다.

2. 세척: 추출한 조직을 미리 차가운 무균 PBS로 수차례 씻어 혈액과 불순물을 제거한다.

3. 잘라내기: 후속 소화를 위해 조직을 약 1-2mm³의 작은 조각으로 잘라냅니다.

세포 분리

1. 소화: 잘게 자른 조직 덩어리를 적당량의 소화효소가 함유된 원심관에 넣고 37 ℃ 의 항온 흔들침대나 배양상자에서 일정 기간 소화한다.그 동안 원심관을 가볍게 흔들어 소화를 균일하게 한다.

2.소화 중지: 조직 덩어리가 대부분 단세포 현액 또는 소세포 덩어리로 소화될 때 혈청을 함유한 배지를 넣어 소화를 중지한다.

3. 여과와 원심: 세포체로 세포현액을 여과하여 소화되지 않은 조직파편을 제거한후 여과액을 적당한 회전속도로 원심분리하여 세포침전을 수집한다.

세포 관찰 및 검사

1.일상 관찰: 매일 거꾸로 현미경으로 세포의 형태, 생장 상태, 밀도 등을 관찰하고 세포의 변화 상황을 기록한다. 예를 들어 세포 오염이나 이상이 발견되면 즉시 상응하는 조치를 취한다.
2.세포 계수 및 활력 검사: 필요할 때 대망람 염색 등 방법으로 세포에 대해 계수와 활력 검사를 진행하여 세포의 생장 상황과 건강 상태를 파악할 수 있다.

1. 취재와 분리

1. 빠른 조작

- 조직 취재 후 즉시 처리하여 실온이나 비영양 환경에 장시간 노출되지 않도록 한다.

- 무균 PBS 또는 생리식염수로 조직을 씻어 혈액, 불순물을 제거한다.

2. 소화효소 선택

- 조직 유형에 따라 소화효소를 선택해 과도한 소화로 인한 세포 손상을 피한다.

- 소화 시간은 엄격히 조절 (보통 10-30 분)해야하며 현미경을 통해 세포의 해리 상태를 관찰 할 수 있습니다.

2. 배양조건의 최적화

1. 배양기 선택

- 혈청 또는 특정 성장인자를 포함하는 배양기(예: DMEM, RPMI 1640 등)를 사용하며, 일부 세포는 인슐린, EGF 등을 첨가해야 한다.

- 배양기 브랜드나 로트 교체가 잦지 않아 세포 적응 스트레스를 줄인다.

2. 벽과 전대

- 원대세포는 벽에 붙이는 능력이 약하여 피배양접시(예를 들어 콜라겐, 폴리우레탄산)를 싸야 할 수도 있다.

- 대물림 시 밀도는 70~80% 로 조절하는 것이 좋으며, 과도한 합류는 접촉 억제와 분화를 초래할 수 있다.

3. 오염통제

1.무균 조작

- 전 과정을 초정대에서 조작하고 일회용 소모품을 사용하여 교차 오염을 피한다.

- 배양기에 이중항성을 첨가할 수 있지만 장기간 사용하면 세포 활성에 영향을 줄 수 있다.

2.지원체 검사

- 정기적으로 지원체 오염(예: PCR법)을 검사하고, 오염 후 세포를 즉시 버려야 한다.

4. 상태 모니터링

1.일상 관찰

- 매일 세포 형태, 밀도 및 배지 색상을 검사하고 배지를 즉시 교체합니다 (일반적으로 2-3일에 한 번씩).

- 비정상적인 형태 (예: 세포가 둥글고 조각이 증가하는 경우) 는 오염이나 영양 부족을 나타낼 수 있습니다.

2.전대와 동존

- 원대세포의 분열 횟수가 제한적(일반 5-10대)이므로 조기 대차세포를 제때에 동결 보관해야 한다.

- 동존액은 DMSO+ 혈청(또는 전용 동존배지)을 사용하는 것이 좋으며, 온도가 내려가면 액체질소로 보존한다.