쥐 원대 가슴 주동맥 평활근 세포 전용 배양기

운영 포인트:

세포 배양 단계:

1. 배양기 및 배양냉동저장조건준비:

1) DMEM-H 배양기 준비(NaHCO3 1.5g/L 추가), 90%;태우 혈청, 10%.실험의 필요에 따라 부유배지를 선택하여 293T 세포를 부유하게 성장시킬 수도 있다.

2) 배양조건: 기상: 공기, 95%;이산화탄소, 5%온도: 섭씨 37도, 배양함 습도는 70~80% 입니다.

3) 동존액: 90% 배양기, 10% DMSO, 현용 현배.액체 질소 저장.

2. 세포 처리:

1) 소생세포: 세포현액 1mL를 함유한 동존관을 37℃ 수욕에서 빠르게 흔들어 해동하고 배지 4mL를 넣어 골고루 섞는다.1000RPM 조건에서 4분간 원심을 분리하고 상청액을 버리고 1-2mL 배양기를 보충한 후 골고루 분다.그리고 모든 세포현액을 배양병에 넣어 밤을 새운다(또는 세포현액을 10cm그릇에 넣고 약 8ml의 배양기를 넣어 밤을 새운다).다음 날 환액하고 세포밀도를 검사한다.

2) 세포 대물림: 세포 밀도가 80~90% 에 달하면 대물림 배양을 할 수 있다.

밀착 세포의 경우 전대는 다음과 같은 방법을 참고할 수 있다.

1. 상청 배양을 버리고 칼슘, 마그네슘 이온이 함유되지 않은 PBS로 세포를 1~2회 윤색한다.

2.소화액 2ml (0.25% Trypsin-0.53mM EDTA) 을 배양병에 넣고 37 ℃ 배양상자에 넣어 1~2분 동안 소화시킨 다음 현미경으로 세포의 소화 상황을 관찰한다. 만약 세포가 대부분 둥글게 변하고 탈락하면 신속하게 조작대로 가져가 배양병을 몇 번 두드린 후 소량의 배양기를 넣어 소화를 종료한다.

3. 6-8ml/병에 따라 배양기를 보충하고 가볍게 두드린 후 빨아들여 1000RPM 조건에서 4분간 원심을 분리하고 청액을 버리고 1-2mL의 배양액을 보충한 후 고루 분다.

4. 세포현액을 1:2에서 1:5의 비율로 배지 8ml를 함유한 새 그릇이나 병에 나눈다.

3) 세포동존: 세포의 생장상태가 양호할 때 세포동존을 진행할 수 있다.붙박이 세포가 동존할 때는 배지를 버리고 소량을 넣어 세포가 둥글게 떨어져 나간 뒤 혈청 함유 배지 약 1ml를 넣은 뒤 동존관에 넣고 DMSO 10%를 추가한 뒤 동존한다.

세포를 냉동 보존하는 방법?

냉동보관방법 1: 냉동관을 4℃ 30~60분→(-20℃ 30분*)→-80℃ 16~18시간(또는 격야)→액체질소탱크 vaporphase에 넣어 장기간 보관한다.

냉동 보존 방법 2: 냉동관은 이미 설정된 프로그램의 프로그램 가능한 냉각기에 설치하여 분당 1-3 ℃ 에서 -80 ℃ 이하로 내린 다음 액체 질소 슬롯 vapor phase에 넣어 장기간 저장한다.-20 ℃ 는 1시간 이상 얼음 결정이 너무 커서 세포가 대량으로 죽는 것을 방지할 수 없으며, 이 단계를 건너뛰고 -80 ℃ 냉장고에 직접 넣을 수도 있지만, 생존율은 약간 낮아진다.